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          首页 跑台运动对大脑中动脉短暂缺血大鼠学习记忆能力及纹状体氨基酸水平

          跑台运动对大脑中动脉短暂缺血大鼠学习记忆能力及纹状体氨基酸水平.doc

          跑台运动对大脑中动脉短暂缺血大鼠学习记忆能力及纹状体氨基酸水平

          落幕的黑夜真孤单
          2019-05-25 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

          简介:本文档为《跑台运动对大脑中动脉短暂缺血大鼠学习记忆能力及纹状体氨基酸水平doc》,可适用于医药卫生领域

          跑台运动对脑缺血大鼠学习记忆能力及纹状体BDNF表达的影响唐伟王霆中北大学体育学院山西太原山西大学体育学院山西太原摘要:目的:跑台运动可以改善脑卒中大鼠的学习记忆能力然而机制尚不清楚。因此本实验通过观察周强迫跑台运动对短暂大脑中动脉(MCAOmiddlecerebralarteryocclusion)栓塞大鼠空间学习记忆能力、血浆皮质酮(Cort)及纹状体氨基酸水平和脑源性神经营养因子BDNF(brainderivedneurotrophicfactor)表达的影响通过研究跑台运动来改善脑梗死大鼠学习记忆功能的可能机制。具体方法:只SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血模型组及脑缺血运动组脑缺血模型组及运动组大鼠制备MCAO短暂缺血模型随后脑缺血运动组大鼠进行周跑台运动。跑台运动结束后通过水迷宫实验测试所有大鼠学习记忆能力的变化随后放射免疫法测试大鼠血浆Cort含量采用高效液相电化学方法检测纹状体Glu、GABA的含量用免疫组织化学结合图像半定量方法对纹状体BDNF神经元的数量及面积进行测量和分析。结果:在水迷宫实验当中脑缺血模型组的大鼠明显要比假手术组的大鼠逃避潜伏期延长(P<)初次找到原平台的时间延长(P<)穿越站台次数减少(P<)血浆皮质酮水平增高(P<)纹状体Glu含量增加(P<)、GABA含量减少(P<)纹状体BDNF表达与假手术组比较无统计学意义(P>)。而长期跑台运动可显著改善MCAO模型大鼠的学习记忆能力大鼠血浆皮质酮水平降低(P<)纹状体Glu含量减少(P<)GABA含量增加(P<)纹状体BDNF表达显著增强(P<)。结论:大脑中动脉(MCAO)短暂缺血大鼠的学习记忆能力可以通过进行长期跑台运动得到改善其机理极有可能与长期跑台运动上调纹状体BDNF的表达拮抗HPA轴功能亢进及兴奋性氨基酸的毒性抑制神经元的坏死及凋亡促进脑缺血后损伤神经元的修复有关。关键词:跑台运动大脑中动脉栓塞大鼠学习记忆皮质酮氨基酸纹状体EffectsofTreadmillTrainingonLearningandMemoryandBDNFExpressionwithinStriatumafterCerebralIschemiaRatsAbstract:Objetive:TreadmillexercisemayenhancetherecoveryofimpairedmemoryfunctioninstrokeratsHoweverthemechanismsunderlyingthesebeneficialeffectsarenotyetknownTherefore,thepurposeofthisstudywastoinvestigatetheeffectsoftheweekforcedtreadmillexerciseonthelearningandmemory,thebloodplasmacortcontent,aminoacidlevelsandBDNFexpressionwithinstriatumofbrainaftertransientmiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)rats,inquiringintothepossiblemechanismoftreadmillexerciseimprovinglearningandmemoryofMCAOratsMethods:maleSDratswererandomlyallocatedtogroups,shamoperationgroup(SO),cerebralischemiamodelgroup(CM)andcerebralischemiaexercisegroup(CE)TheratsofCMandCEgroupratsweresubmittedtothetransientmiddlecerebralarteryocclusion,subsequentlytheCEgroupratsreceivedweekforcedtreadmillexerciseThenallratsweresubmittedtobehavioraltestingforspatialmemorybytheMorriswatermazethenthebloodplasmacortcontentwasdetectedbyradioimmunoassay,subsequentlytheconcentrationofGluandGABAwereexaminedbyhighperformanceliquidelectrochemicaldetectionandBDNFexpressionwithinstriatumwasdetectedandanalysisedbyusingimmuneohistochemicalmethodResults:ComparedwiththeSOgrouprats,escapinglatencysignificantlyprolonged(P<),thefirsttimetofindingoriginalplatformprolonged(P<)andtheplatformcrossingssignificantlydecreased(P<)intheMorriswatermazeandthebloodplasmacortcontentincreased(P<)intheCMgroupratsGlucontentincreased(P<),GABAcontentdecreased(P<)BDNFexpressionwithinstriatumwasnotstatisticaldifference(P>)inCMgroupratswhencomparedtotheSOgroupratsResultsshowedthatforcedtreadmillexercisemaysignificantlyimprovelearningandmemoryoftheMCAOmodelratsthebloodplasmacortcontentdecerased(P<),Glucontentdecreased(P<),GABAcontentincreased(P<)andBDNFexpressionwithinstriatumsignificantlyenhanced(P<)intheCEgroupratswhencomparedtotheCMgroupratsConclusion:Treadmillexercisemayimprovethelearningandmemoryabilityaftertransientmiddlecerebralarteryocclusionrats,itsmechanismmightbethattreadmillexerciseupregulateBDNFexpression,overactiveHPAaxisantagonismanddecreaseGluneurotoxicitywithinstriatum,inhibitneuronalnecrosisandapoptosisandpromotetherepairofdamageneuronsKeywords:TreadmillexerciseMCAOmodelratslearningandmemoryCortaminoacidBDNF脑卒中(Stroke)是世界上死亡率及致残率最高的疾病之一其中脑梗塞最为常见。大脑中动脉(MCAO)栓塞是脑卒中的常见原因因此大脑中动脉栓塞再灌注模型可以较好地模拟临床脑卒中的病理过程而常被使用。研究发现脑卒中后患者不仅会出现记忆功能障碍还会出现运动功能障碍严重影响病人的生活质量。多数学者研究认为运动锻炼有助于维持脑的功能和促进脑的可塑性可以明显改善脑卒中病人的认知功能障碍。Shimada等通过水迷宫实验证实低强度跑台运动可以通过减小大脑中动脉栓塞模型大鼠的梗死面积从而改善脑缺血大鼠的学习记忆能力。以上数据表明跑台训练对脑缺血有保护作用然而具体机制尚不清楚。在中枢神经系统中纹状体是对缺血性卒中比较敏感的核心区域之一且纹状体Glu(谷氨酸)、GABA神经元含量较多。许多研究证实脑缺血过程中脑内特别是缺血中心区域氨基酸类神经递质尤其是兴奋性氨基酸如谷氨酸(glutamicacidGu)的过量释放是缺血性脑损伤的重要因素之一在脑缺血神经功能的损害中起着关键作用。脑源性神经营养因子BDNF属于神经营养因子家族成员研究报道BDNF不仅涉及神经发育而且在脑卒中后损伤神经元再生修复方面发挥重要作用。近年来围绕脑缺血急性期大脑BDNF的变化研究较多但是有关脑缺血后BDNF后期变化相关文献较少而且长期有氧运动改善脑缺血大鼠学习记忆能力的机制尚不清楚。因此本实验通过复制大鼠大脑中动脉(middlearterycerebralocclusionMACO)栓塞再灌注模型观察长期跑台训练对MCAO模型大鼠空间学习记忆能力、纹状体氨基酸水平及BDNF表达的变化探讨跑台运动改善大脑中动脉栓塞再灌注模型大鼠空间学习记忆能力下降的可能机制。材料及方法动物及分组雄性健康SD大鼠只鼠龄个月体质量()g室温(±)℃湿度(±)大鼠自由摄食、饮水。将只大鼠随机分为假手术组(shamoperationgroupSO)脑缺血模型组(cerebralischemiamodelgroupCM)及脑缺血运动组(cerebralischemiaexercisegroupCE)。动物MCAO模型制备模型组和运动组大鼠制作短暂大脑中动脉栓塞实验动物模型。腹腔注射%水合氯醛(mlkg)麻醉大鼠后切开大鼠颈部正中用镊子钝性分离右侧颈总动脉(rightcommoncarotidarteryCCA)、颈外动脉(externalcarotidarteryECA)和颈内动脉(internalcarotidarteryICA)。结扎右侧ECA远心端斜剪一切口将预先处理过的直径mm的尼龙线圆钝端沿切口插入近心端将尼龙线沿右侧颈内动脉走向缓慢推进()mm左右直至尼龙线顶端有阻塞感以阻断右大脑中动脉入口造成右侧大脑中动脉供血区的缺血min后缓慢退出尼龙线实施再灌流。在实验过程中大鼠肛温控制在(±)℃待清醒后放回笼中。假手术组除不阻塞大脑中动脉其它手术步骤同脑缺血模型组。模型成功的分级标准参考Longa的方法为:分无神经损伤症状分不能完全伸展左侧前爪分向左侧转圈分向左侧倾倒分不能自发行走意识丧失。手术后神经功能评分为~分的大鼠入选本次研究剔除分、分或死亡大鼠。训练方案MCAO模型组与假手术组大鼠置于普通笼内常规饲养期间可自由活动进食饮水。MCAO运动组大鼠在术后天予以强迫跑台训练连续周每天min跑台坡度为度。跑速如下:第一天mmin第二天mmin接下来每天mmin。水迷宫实验(MWMMorriswatermaze)跑台训练结束后第二天用Morris水迷宫评估大鼠的学习记忆能力。水迷宫为圆形水槽直径cm直径厘米的平台放在水池西北象限的中央平台低于水面lcm水温℃实验程序包括天定位航行实验定位航行实验结束后小时测试大鼠空间探索实验迷宫上方安置摄像机记录大鼠游泳轨迹。①定位航行实验:实验前一天将大鼠放入没有平台的水槽中自由游泳s使其熟悉迷宫环境。定位航行实验历时天每天将大鼠面向池壁从东、西、南、北个入水点下水训练次每只大鼠允许s找到平台如果s后大鼠未找到平台逃避潜伏期记作s并引导其到平台上停留s后用吹风机吹干大鼠放进鼠笼min后进行下一次实验。每天次训练逃避潜伏期成绩的平均值作为当日最终成绩进入最后统计。②空间探索实验:定位航行实验完成后第天将平台从水中撤出由任一入水点下水将大鼠放入水中记录每只大鼠s跨越原平台的次数及在原平台象限停留的时间。大鼠脑组织纹状体谷氨酸及γ氨基丁酸含量测定每组只大鼠水迷宫行为测试结束后即刻断头取脑于冰盘上迅速分离纹状体(大脑右侧)称重用molL磷酸盐缓冲液在冰上制备脑组织纹状体匀浆rmin离心min取上清液ml按照试剂盒说明测定大鼠纹状体组织匀浆中Glu及GABA含量。纹状体BDNF取材与切片每组剩余只大鼠行为测试结束后即刻经腹腔注射戊巴比妥钠(mgkg)麻醉开胸用多聚甲醛常规灌注去除大脑蔗糖溶液后固定。固定后石蜡包埋然后将脑组织切成片厚μm的切片然后进行BDNF免疫组织化学染色。将石蜡切片置于℃烤箱中烘烤h二甲苯脱蜡次入HO甲醇液室温处理min然后滴加BDNF兔抗鼠血清第一抗体(:℃孵育h)PBS液洗次每次min随后加入生物素标记的羊抗兔第二抗体ul℃孵育h接着DAB室温显色min苏木素复染、裱片、梯度酒精脱水、透明、封片。大鼠血浆cort含量测试行为测试结束后即刻腹腔注射戊巴比妥钠(mgkg)麻醉灌注及断头取脑的同时从大鼠左心室取血ml将从每只大鼠抽出的ml血液放入加入肝素钠的试管rmin、℃离心min吸弃上清液分离血浆置于℃低温冰箱中保存严格按照说明书操作测定大鼠血浆cort含量。图像分析和统计学处理用数码生物显微镜和形态学显微图像分析系统参照大鼠脑立体定位图谱随机选取纹状体相同区域的个视野计数大鼠缺血侧纹状体区BDNF(倍)阳性细胞数及面积。组间数据结果比较采用SPSSl统计软件包进行单因素方差分析比较前先进行方差齐性检验方差齐采用LSD法检验方差不齐采用Dunnetts法检验数据结果采用mean±SD表示以P<认为具有统计学意义。图A冠状位下纹状体截面图箭头所示(?)图BC纹状体BDNF阳性神经元分布(**FigA:coronalsectionfordissectioninstriatum(arrow)FigBC:distributionofBDNFinstriatum(*,*)研究结果术后大鼠观察MCAO术后多数大鼠于h内清醒对照组清醒后进食及活动很好未见明显神经功能缺损症状术后h所有MCAO大鼠均可自由摄食和饮水术后h神经功能缺损有所恢复h后大部分大鼠神经功能缺失表现不明显术中及术后两天脑缺血模型组及运动组大鼠各死亡只。大鼠水迷宫实验测试结果大鼠水迷宫定位航行实验测试结果由表图可知各组大鼠d内寻找平台的时间越来越短表明大鼠在d的游泳训练中对寻找隐藏在水中的平台均有一定的记忆能力。假手术组大鼠平均逃避潜伏期很快下降而脑缺血模型组及运动组大鼠平均逃避潜伏期缓慢下降且波动很大。每组大鼠纵向数据表明从水迷宫训练的第l天起脑缺血模型组大鼠比假手术组大鼠逃避潜伏期明显延长(P<)。脑缺血运动组大鼠水迷宫训练的第l天逃避潜伏期显著高于假手术组(P<)第天开始差异较稳定但仍具有显著性(P<)脑缺血模型组大鼠从水迷宫训练的第天逃避潜伏期明显短于模型组大鼠(P<)。表各组大鼠Morris水迷宫定位航行实验结果一览表(n=)TableResultsoflocationnavigationbrainintheMorriswatermazetestinvariousgroupsrats(,n=)逃避潜伏期(s)组别第一天第二天第三天第四天第五天假手术组±±±±±脑缺血模型组±##±##±##±##±##脑缺血运动组±##±##±##±#*±#*??????注:##P<#P<与假手术组比较ComparedwiththeSOgroup**P<*P<与脑缺血模型组比较ComparedwiththeCMgroup大鼠空间探索实验测试结果由表可知min内与假手术组大鼠比较脑缺血模型组大鼠初次找到原平台的时间延长(P<)延长幅度为穿越站台次数较假手术组均明显减少(P<)减少幅度为与模型组比较脑缺血运动组大鼠初次找到原平台的时间显著缩短(P<)缩短幅度为穿越站台次数显著增多(P<)增加幅度为。表各组大鼠Morris水迷宫空间搜索实验结果一览表()TableResultsofspatialprobetestinMorriswatermazetestinvariousgrouprats()组别例数(n)跨越原平台的次数(次)初次找到原平台的时间(s)假手术组±±脑缺血模型组±##±##脑缺血运动组±#*±#**????注:##P<#P<与假手术组比较Comparedwiththeshamoperation**P<*P<与脑缺血模型组比较ComparedwiththeMCAOmodelgroup各组大鼠血浆皮质酮及纹状体Glu及GABA测试结果表结果显示:模型组大鼠纹状体Glu含量与假手术组比较显著增加(P<)增加倍GABA含量显著下降(P<)下降幅度为脑缺血运动组大鼠Glu含量与模型组相比显著下降(P<)下降幅度为GABA含量比模型组显著增高(P<)增加幅度为。表所示脑缺血模型组大鼠与假手术组比较血浆cort含量显著增加(P<)上升幅度为脑缺血运动组大鼠血浆cort含量与假手术组比较无统计学意义(P>)经过周跑台运动与脑缺血模型组比较脑缺血运动组大鼠血浆cort含量显著下降(P<)下降幅度为。表各组大鼠血浆cort及纹状体谷氨酸及γ氨基丁酸测试结果()TableResultsofbloodplasmacortcontentandGluandGABAcontentwithinstriatumofratsinvariousgroups()组别例数(n)Glu(μmolL)GABA(μmolg)cort(ngml)假手术组±±±脑缺血模型组±##±##±#脑缺血运动组±#**±#*±*?????注:##P<#P<与假手术组比较ComparedwiththeSOgroup**P<*P<与脑缺血模型组比较ComparedwiththeCMgroup各组大鼠缺血侧纹状体BDNF表达结果图BC所示光镜下可见纹状体内分布有大量的BDNF低倍镜下为褐色小圆点(图B)高倍镜下BDNF神经元大小不一胞核淡染胞浆染色为深褐色胞体形态多种多样呈椭圆形或圆形(图C)。图像分析结果显示(表图AC)脑缺血模型组大鼠缺血侧纹状体BDNF阳性细胞表达与假手术组比较无统计学意义(P>)与假手术组比较脑缺血运动组大鼠纹状体BDNF数量及面积均显著增多(P<P<)增加幅度分别为及与脑缺血模型组大鼠比较脑缺血运动组大鼠纹状体BDNF阳性细胞数量及面积均显著增加(P<P<)增加幅度分别为及。表各组大鼠右侧纹状体BDNF阳性细胞数和面积测定结果一览表()TableResultsofBDNFpositivecellnumberandareawithinlesionedstriatumofratsinvariousgroups()组别例数(n)阳性细胞数量(number)面积(area)假手术组±±脑缺血模型组±±脑缺血运动组±##**±##**????注:##P<#P<与假手术组比较ComparedwiththeSOgroup**P<*P<与脑缺血模型组比较ComparedwiththeCMgroup图AC:缺血侧纹状体BDNF阳性神经元分布。免疫组织化学结果显示脑缺血模型组大鼠纹状体BDNF阳性神经元表达(?)与假手术组比较无统计学意义跑台运动周后运动组大鼠纹状体BDNF免疫阳性神经元表达与模型组比较显著增强(?)。bar=μm(AC)A:假手术组B:脑缺血模型组C:脑缺血运动组。FigAC:ThedistributionofBDNFimmunoreactiveneuronswithinstriatumImmunohistochemistryshows:BDNFexpression(?)wasnotstatisticaldifferenceinCMgroupratswhencomparedtotheSOgroupratsBDNFexpression(?)significantlyincreasedinCEgroupratswhencomparedwithCMgroupratsbar=μm(AC)A:shamoperationgroupB:cerebralischemiamodelgroupC:cerebralischemiaexercisegroup讨论本研究通过水迷宫实验证实短暂大脑中动脉栓塞严重削弱了大鼠学习记忆能力而周跑台运动显著增强了脑缺血大鼠的学习记忆能力具体表现为水迷宫实验中脑缺血运动组大鼠逃避潜伏期缩短平台停留时间延长穿越站台次数增加与前期学者研究结果一致。皮质酮是HPA轴的重要激素Milot等采用结扎双侧颈总动脉和造成大鼠脑缺血再灌注模型皮质酮过度分泌一直延续到缺血后一个星期说明脑缺血再灌注后伴发HPA轴功能紊乱导致皮质酮含量增高对脑功能造成一定损害与脑缺血引起的学习记忆能力下降有关。我们的实验发现大鼠单侧(右侧)大脑中动脉栓塞d大鼠Cort水平显著高于假手术组学习记忆能力下降可能与应激激素Cort的过度分泌有关。研究认为mmin的跑台运动可提高脑缺血大鼠的血清皮质酮水平并且Kim等研究认为mmin的跑台运动可以恢复应激障碍等疾病引起的HPA轴失调。因此为了避免跑台运动对脑缺血大鼠的应激刺激本实验大鼠的跑台速度为、、mmin结果发现脑缺血运动组大鼠血浆皮质酮水平显著低于脑缺血组大鼠因此可以认为周跑台运动改善脑缺血大鼠学习记忆能力与血浆皮质酮水平下降有关。

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